超高分辨率熒光顯微鏡的應(yīng)用前景

 1、 光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)及其影響自荷蘭博物學(xué)家、顯微鏡創(chuàng)制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世紀(jì)第一次將光線通過透鏡聚焦制成光學(xué)顯微鏡并用它觀察微生物(microorganisms or animalcule)以來，顯微鏡就一直是生物學(xué)家從事研究工作、探尋生命奧秘必不可少的利器。正是因?yàn)橛辛?span lang="EN-US">Leeuwenhoek的這項(xiàng)偉大發(fā)明及其后繼者對顯微鏡技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，人們才能夠?qū)?xì)胞內(nèi)部錯(cuò)綜復(fù)雜的亞細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)的形態(tài)有了初步的了解。

    此后，研究人員對顯微鏡技術(shù)的追求從未停歇過，他們總是希望能得到分辨率更高的顯微鏡，從而更好地觀察細(xì)胞內(nèi) 部更細(xì)微的結(jié)構(gòu)。最近，《自然-方法》(Nature Methods)雜志上報(bào)道的超高分辨率成像技術(shù)(super-resolution imaging, SR imaging)終于使得人們可以在單分子水平上進(jìn)行觀察研究。

科信儀器熒光顯微鏡：http://www999938.com/search-141-0.shtml

2 、SR技術(shù)的發(fā)展過程

    在達(dá)到今天SR技術(shù)水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動(dòng)的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

    在以上這些光學(xué)SR成像技術(shù)中有兩種技術(shù)——受激發(fā)射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)最受關(guān)注。

    最近，基于探針SR成像技術(shù)的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團(tuán)隨機(jī)激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經(jīng)取得了成功。

    通過基于探針的SR成像技術(shù)，可以獲得多張?jiān)紙D像。在每一張?jiān)紙D像中，細(xì)胞內(nèi)只有一部分被熒光標(biāo)記的分子能發(fā)出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態(tài)，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發(fā)出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會受到影響，也就避免了因相鄰分子發(fā)出熒光而無法分辨的問題。最后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了最終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點(diǎn)太密以至于無法成像的結(jié)構(gòu)的分辨率達(dá)到納米級水平，而且成像的分子密度也相當(dāng)高，可以達(dá)到105個(gè)分子/μm2。

    這種分辨率對于生物學(xué)家來說，意味著現(xiàn)在可以在分子水平上觀察細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)過程了。

    雖然顯微鏡技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了如此高度，但它仍然只是生物學(xué)家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗(yàn)結(jié)果互相參照，才能獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。人們需要認(rèn)清SR顯微鏡的優(yōu)勢與劣勢，為操作以及判斷SR圖像制定出標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范，只有這樣才能最大限度地發(fā)揮SR顯微鏡的作用。

    現(xiàn)在，由于人們對細(xì)胞內(nèi)各組份的組織結(jié)構(gòu)以及它們的動(dòng)態(tài)變化過程都只有一個(gè)概念上的認(rèn)識，因此，借助顯微鏡從納米水平上對這些結(jié)構(gòu)及過程進(jìn)行真實(shí)的觀察能讓人們發(fā)現(xiàn)許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架是由大量絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成時(shí)，就有人對此現(xiàn)象持懷疑態(tài)度。那些認(rèn)為細(xì)胞骨架是一種用來稀釋細(xì)胞內(nèi)生化物質(zhì)濃湯這樣一種結(jié)構(gòu)的細(xì)胞生物學(xué)家把這種觀測結(jié)果稱作僵化的人為試驗(yàn)結(jié)果。

    除非最新的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗(yàn)結(jié)果都能證明細(xì)胞骨架是由大量的絲狀網(wǎng)格樣組織構(gòu)成的，否則還會有人持上述的懷疑觀點(diǎn)。不過已經(jīng)有其它的生化試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了早期的電鏡觀察結(jié)果是正確的。當(dāng)然新興的SR技術(shù)也需要其它傳統(tǒng)的生化試驗(yàn)結(jié)果予以佐證才有價(jià)值，同時(shí)還需要電鏡的輔助。因?yàn)殡婄R能提供納米級的觀察結(jié)果，這對于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測結(jié)果來說是最有價(jià)值的。

    今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時(shí)，需要注意將會出現(xiàn)的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關(guān)的缺點(diǎn)及其目前的解決方法。

    最近幾年，就如何處理圖像已經(jīng)有了非常嚴(yán)格的操作規(guī)范。不過迄今為止，對于怎么處理SR圖像還沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數(shù)據(jù)在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細(xì)胞內(nèi)該分子有可能出現(xiàn)的任何地點(diǎn)都標(biāo)示出來了。而且只有被標(biāo)記的分子按照一定的標(biāo)準(zhǔn)(發(fā)出的光子數(shù))判斷它的確是一個(gè)單分子并且定位準(zhǔn)確之后才顯示出來。必須對獲得的圖像進(jìn)行這樣的標(biāo)準(zhǔn)化處理之后才能分析結(jié)果。同樣，對于試驗(yàn)數(shù)據(jù)也需要如此進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數(shù)目夠多，以致能達(dá)到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會影響SR顯微鏡的應(yīng)用，但由于存在這些問題，所以我們應(yīng)該時(shí)刻提醒自己，一定要仔細(xì)判讀、分析SR顯微鏡的圖像結(jié)果，只有這樣才能得到有價(jià)值的生物學(xué)結(jié)論。

3、 SR熒光顯微鏡在生物學(xué)研究中的應(yīng)用

     到目前為止，人們還很難得知，SR熒光顯微鏡會對生物學(xué)界的哪一個(gè)領(lǐng)域帶來重大變革，但已經(jīng)有幾個(gè)領(lǐng)域出現(xiàn)了明顯的改變。這些研究領(lǐng)域是動(dòng)態(tài)及靜態(tài)的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域、非均質(zhì)分子組織研究領(lǐng)域、蛋白動(dòng)態(tài)組裝研究領(lǐng)域等。這幾個(gè)領(lǐng)域都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，那就是它們研究的重點(diǎn)都是分子間如何相互作用、組裝形成復(fù)合物。因此，能在納米水平觀察這些分子對它們來說具有重大的意義。

1、通過觀察蛋白質(zhì)之間的組合關(guān)系來了解它們的作用，并能為后續(xù)的細(xì)胞功能試驗(yàn)打下基礎(chǔ)

     結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究在這方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4-8納米大小的分子間相互作用組裝成細(xì)胞微管、肌絲、中間絲這些超過10微米大小聚合物的機(jī)制。不過對于核孔復(fù)合體、中心體、著絲點(diǎn)、中間體、粘著斑這些由許多不同蛋白經(jīng)過復(fù)雜的三維組裝方式組合起來的復(fù)合體，還需要更好的辦法來進(jìn)行研究。目標(biāo)就是要達(dá)到分子水平的分辨率，這樣就可以觀察大復(fù)合體形成過程中的單個(gè)分子，也就能對這些分子的化學(xué)計(jì)量學(xué)有所了解了。要得到更多的生物學(xué)信息就需要SR顯微鏡這樣的三維成像技術(shù)，例如可以使用活體細(xì)胞SR成像捕捉細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)重構(gòu)過程等等。

2、 SR成像有助于人們更好地了解分子間的差異

     細(xì)胞膜蛋白組織方式的經(jīng)典模型已經(jīng)從隨機(jī)分布的液態(tài)鑲嵌模型轉(zhuǎn)變成了脂筏模型、穴樣內(nèi)陷模型或特殊蛋白模型。這種差異與細(xì)胞不同功能相關(guān)，例如在高爾基體、cargo蛋白和高爾基體酶蛋白之間必須發(fā)生相互作用，但最終它們會按照各自的功能分開，發(fā)揮各自的作用。有很多試驗(yàn)手段，例如免疫電鏡技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)等都已經(jīng)被用來研究這種膜不均一性問題了。多色PALM技術(shù)(Multicolor PALM)為人們提供了一種新的手段用來觀察膜蛋白集合、組織的過程，并且還能定量分析不同蛋白間的空間距離關(guān)系。因?yàn)橛辛?span lang="EN-US">PALM提供的單分子信息，人們就可以清楚地了解蛋白分子間的空間關(guān)系，甚至有可能計(jì)算出相隔某一距離的分子之間發(fā)生相互作用的可能性。這種方法除了用于研究膜蛋白之外，還能用于許多非隨機(jī)分布的生物系統(tǒng)研究，例如研究微管上的馬達(dá)蛋白。

3、 SR成像技術(shù)還能用于在單分子水平研究蛋白動(dòng)態(tài)組裝過程

    細(xì)胞對外界刺激信號的反應(yīng)起始于胞膜，在胞膜上受體蛋白之間發(fā)生動(dòng)態(tài)的集合，用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的反應(yīng)活性。像HIV這種有被膜病毒也是在細(xì)胞膜上完成病毒顆粒組裝過程的病毒，也是利用了細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。盡管現(xiàn)在蛋白組裝的物理模型還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有完成，但研究人員知道膜蛋白的動(dòng)態(tài)組裝過程是不均一的，所以通常使用熒光試驗(yàn)手段很難獲得分子水平上的信息。同樣，單分子測量技術(shù)(Single molecule measurements)也存在著類似的局限，因?yàn)閱畏肿訙y量技術(shù)只能觀察細(xì)胞內(nèi)的幾個(gè)分子，所以缺乏整體的信息。因此由于缺乏空間分辨率，很難動(dòng)態(tài)地研究蛋白質(zhì)組裝過程。SR熒光成像技術(shù)與活細(xì)胞成像技術(shù)和單分子示蹤技術(shù)(sptPALM)結(jié)合就能解決這一問題。我們可以借助分子密度準(zhǔn)確地看出PALM圖像中的蛋白質(zhì)簇，蛋白質(zhì)簇動(dòng)態(tài)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)能幫助我們了解蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)組裝的機(jī)制。

    上面只是選了生物學(xué)研究中的3個(gè)方面來說明SR技術(shù)的用途，但這已經(jīng)很好的展示了我們是如何從Leeuwenhoek最初對于生命組成的假設(shè)一步一步走到了今天，使用SR顯微鏡來證實(shí)構(gòu)成生命體的最基本材料——分子的組合過程。STED和PALM的商業(yè)化產(chǎn)品已經(jīng)上市了，這標(biāo)志著SR顯微鏡的時(shí)代來臨了。我們相信SR顯微鏡在充滿創(chuàng)造力的生物學(xué)家們手中，一定會充分發(fā)揮它的作用，幫助我們發(fā)現(xiàn)更多生命的奧秘。

三 可誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞技術(shù)新進(jìn)展

    近幾年，將體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞的技術(shù)已經(jīng)有了很大的改進(jìn)和提高?？梢灶A(yù)見，將來這些技術(shù)還會得到進(jìn)一步的發(fā)展?，F(xiàn)在，關(guān)于這方面的生物學(xué)研究不斷涌現(xiàn)。

    早在一年前，人們就將可誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluri-potent (iPS) stem cells)技術(shù)作為一個(gè)值得關(guān)注的研究領(lǐng)域進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道。但直到最近，該技術(shù)(在體細(xì)胞中表達(dá)幾種轉(zhuǎn)錄因子即可將體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞)才能成功應(yīng)用于人體體細(xì)胞。

    該技術(shù)體系的用途之廣泛是顯而易見的。例如，可以用于研究人體早期發(fā)育過程、構(gòu)建疾病模型或應(yīng)用于臨床治療等等。然而該技術(shù)還是存在幾個(gè)亟待解決的問題。

    值得高興的是，目前已經(jīng)有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在iPS技術(shù)的以下幾個(gè)方面取得了進(jìn)展。有的實(shí)驗(yàn)室能對更多種類的體細(xì)胞進(jìn)行重編程;有的實(shí)驗(yàn)室能使用小分子而非轉(zhuǎn)錄因子成功重編程體細(xì)胞;還有的實(shí)驗(yàn)室操作過程中使用的轉(zhuǎn)錄因子比以往少幾種，但重編程效率卻較之以往提高了100倍?，F(xiàn)在，篩選哪些轉(zhuǎn)錄因子或小分子物質(zhì)，對于重編程來說是必須的研究，而且還在進(jìn)行之中。

    最近有報(bào)道稱，在小鼠體細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)重編程因子也能成功獲得iPS細(xì)胞。這就避免了使用病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子這種傳統(tǒng)方法可能造成的病毒整合入細(xì)胞基因組等問題的發(fā)生。

    除了繼續(xù)追求技術(shù)上的進(jìn)步之外，科學(xué)家還將從基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)、細(xì)胞分化等各個(gè)方面深入研究iPS細(xì)胞本身的生物學(xué)問題，這些方面都將影響到iPS細(xì)胞將來的應(yīng)用，并且我們堅(jiān)信這將是未來iPS細(xì)胞研究領(lǐng)域發(fā)展的新方向。

四 人造生命

    在人們成功合成人造基因組之后，下一步就該是發(fā)揮這些基因的功能了。

    合成生物學(xué)(見文后小詞典)最主要的長期目標(biāo)之一就是使用最小的、非冗余的基因組構(gòu)建一個(gè)具有某種功能的活體生命。而短期內(nèi)亟待解決的問題則是，如何使用未經(jīng)加工的化學(xué)原料組裝一個(gè)完整的基因組以及非必需基因(nonessential genes)等。

    2008年，研究人員終于在基因組組裝問題上取得了突破性進(jìn)展。J. Craig Venter等人使用體外重組技術(shù)(in vitrorecombination strategy)將一段長約24Kb的寡聚核苷酸鏈和另一段更長的核苷酸鏈重組，然后將該重組體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，最終獲得了長達(dá)582.9Kb的生殖支原體(Mycoplasma genitalium)基因組。Mitsuhiro Itaya等人則使用體內(nèi)重組技術(shù)(in vivo recombination strategy)在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)內(nèi)將一系列長約4~6Kb的多米諾骨牌樣克隆(domino clones)組裝在一起，獲得了長約134.5Kb的水稻線粒體(rice chloroplasts)基因組。

    接下來的工作就是檢驗(yàn)這些人造基因組是否具有相應(yīng)功能了。Venter等人已經(jīng)成功將絲狀支原體(M. mycoides)的基因組植入了山羊支原體(M. capricolum)細(xì)胞中，現(xiàn)在，他們準(zhǔn)備將人工合成的生殖支原體基因組移植入山羊支原體細(xì)胞中，不過這一試驗(yàn)在技術(shù)上還是存在一定的難度，因?yàn)樗⒉荒芟駥⒔z狀支原體的基因組植入山羊支原體細(xì)胞中那么容易。而且人造基因組是否能在酵母細(xì)胞中正確組裝，而不被胞內(nèi)限制性核酸酶消化，并復(fù)制、編碼形成一個(gè)活的細(xì)菌(支原體)還需要試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。另一個(gè)需要解決的問題就是如何優(yōu)化密碼子。人造基因組對于其宿主細(xì)胞來說是不能有毒性的。然而，一個(gè)完整的基因組必須被植入受體細(xì)胞中并且要能夠表達(dá)出它自己編碼的功能蛋白。

    毫無疑問，這種人造生命技術(shù)與其它的新技術(shù)一樣，肯定會引起眾多的爭議，甚至恐慌，但它對于了解生命，對于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的進(jìn)步來說也的確會起到不可估量的作用。

五 圖像自動(dòng)識別系統(tǒng)

    借助圖像自動(dòng)識別系統(tǒng)(Automated imaging)，人們能對顯微鏡下的圖像進(jìn)行定量分析，并拓展顯微鏡的用途。

    自從顯微鏡誕生以來，它就一直是科學(xué)家進(jìn)行科學(xué)研究的得力助手。不過，顯微鏡圖像一直只能算是一個(gè)描述性的結(jié)果，不能進(jìn)行定量分析，而且進(jìn)行顯微鏡觀察是一項(xiàng)非常費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的工作，這些缺陷一直阻礙著顯微鏡的廣泛應(yīng)用。

    當(dāng)Antonie van Leeuwenhoek在15世紀(jì)60年代第一次使用他自制的顯微鏡觀察到微生物的時(shí)候，當(dāng)Santiago Ramón y Cajal在200多年前第一次觀察到神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的時(shí)候，他們都已經(jīng)花費(fèi)了很長的時(shí)間來進(jìn)行觀察工作，同時(shí)還需要花費(fèi)很長時(shí)間將鏡下的一切描繪到紙上。今天，科學(xué)家使用比當(dāng)年先進(jìn)得多的顯微鏡以及電荷耦合照相機(jī)(CCD camera)就能馬上獲得比當(dāng)年清晰得多的圖像，但是對于大多數(shù)的生物學(xué)家來說，他們使用顯微鏡還是只能通過大量的鏡下觀察來得到一個(gè)描述性的圖像結(jié)果而已。

    不過現(xiàn)在，借助計(jì)算機(jī)技術(shù)以及各種復(fù)雜的算法，顯微鏡可以有更多、更大的作為了。如今，已經(jīng)發(fā)展到使用計(jì)算機(jī)來控制顯微鏡進(jìn)行大部分的圖像采集工作，顯微鏡下的圖像結(jié)果不僅僅是描述性的，還可以通過計(jì)算機(jī)的運(yùn)算對圖像結(jié)果進(jìn)行定量分析。這一切進(jìn)步都是以往單單使用肉眼進(jìn)行觀察所無法比擬的。

    即使對于那些目前還不能進(jìn)行自動(dòng)化分析的項(xiàng)目，例如在體內(nèi)或體外試驗(yàn)中分析大量細(xì)胞中的基因表達(dá)水平，如果能夠進(jìn)行自動(dòng)化分析，也將大大提高檢測的效率和定量分析的準(zhǔn)確度。

    自動(dòng)圖像采集技術(shù)需要一系列相關(guān)技術(shù)協(xié)同作用才能成功。例如，需要使用合適的算法、需要選擇合適的結(jié)果分析方式等等。雖然這些技術(shù)正在逐漸被大家所了解和使用，但目前還只是剛剛開始，還不成熟，還需要進(jìn)一步的改進(jìn)，才能滿足更多科研人員的實(shí)際需要。對于自動(dòng)圖像采集技術(shù)的新老用戶來說，在使用的時(shí)候都要小心仔細(xì)地進(jìn)行操作和分析，不過相比該技術(shù)所可能帶來的令人激動(dòng)的成果而言，這樣的謹(jǐn)慎還是相當(dāng)值得的。

六 定量質(zhì)譜檢測技術(shù)

    現(xiàn)在，大量使用基于定量質(zhì)譜檢測技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法來研究生物問題正變得越來越常見了。

    使用質(zhì)譜技術(shù)來檢測蛋白質(zhì)已經(jīng)成為了一種常規(guī)方法，并且正越來越多地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究當(dāng)中。但是要真正了解復(fù)雜生物體的生物學(xué)情況，還需要有關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平方面的資料。不幸的是，傳統(tǒng)的質(zhì)譜檢測技術(shù)還不具備定量的能力。

    因此，在過去的10年間，從事蛋白質(zhì)組學(xué)研究的科研工作者發(fā)明了一系列的穩(wěn)定同位素標(biāo)記策略(stable-isotope labeling strategy)，希望藉此獲取定量信息。

    同時(shí)，檢測設(shè)備和生物信息學(xué)方面最近取得的進(jìn)展也使得定量質(zhì)譜檢測技術(shù)成為了可能。僅就去年一年，就有好幾項(xiàng)值得人們注意的蛋白質(zhì)組學(xué)研究成果發(fā)表，尤其值得關(guān)注的是使用由Matthias Mann小組在2002年發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素氨基酸標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)這類代謝標(biāo)記技術(shù)(metabolic labeling techniques)獲得的研究成果。2008年，Mann小組和其他科研人員發(fā)現(xiàn)，只需使用少量標(biāo)記物，就可以對整只小鼠進(jìn)行同位素標(biāo)記，對細(xì)胞周期內(nèi)的磷酸化動(dòng)力學(xué)情況進(jìn)行研究，了解miRNA對蛋白質(zhì)組的影響效果，以及比較單倍體酵母和雙倍體酵母的蛋白質(zhì)組學(xué)情況等等。

    不過，要對蛋白質(zhì)水平進(jìn)行絕對的定量，只能通過往已消化的蛋白質(zhì)組樣品中摻入已知數(shù)量的人工合成同位素標(biāo)記肽段才能獲得，這一方法是由Steven Gygi小組在2003年首先提出的。不過，在得到能代表所有蛋白質(zhì)的同位素標(biāo)記的水解肽段(isotope-labeled proteotypic peptides，這些肽段最有可能被質(zhì)譜儀連續(xù)捕捉到)以前，要想得到蛋白質(zhì)組的整體絕對定量數(shù)據(jù)是根本不可能的。

    研究人員希望，在不久的將來能更好地運(yùn)用同位素代謝標(biāo)記的方法來進(jìn)行研究，幫助人們使用質(zhì)譜檢測技術(shù)從蛋白質(zhì)組學(xué)的層面。

七 膜蛋白結(jié)構(gòu)解析技術(shù)新進(jìn)展

    蛋白表達(dá)、溶解和結(jié)晶這一系列技術(shù)瓶頸的突破，使得研究膜蛋白的原子結(jié)構(gòu)成為可能。

    細(xì)胞中有大約30%的蛋白質(zhì)是膜蛋白，不過人們現(xiàn)在還不是很清楚這些膜蛋白的原子結(jié)構(gòu)。到目前為止，在PDB(Protein Data Bank)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中只有不到1%的資料是膜蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。這不是說膜蛋白的結(jié)構(gòu)不重要，相反，膜受體蛋白非常重要，它們是大部分藥物的作用靶點(diǎn)。但由于一直缺乏很好的膜蛋白大量可溶性表達(dá)技術(shù)，因此也就得不到足夠的蛋白結(jié)晶體用于結(jié)構(gòu)分析。即使是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(文后小詞典)這項(xiàng)旨在分析每一個(gè)蛋白家族結(jié)構(gòu)的學(xué)科，也因?yàn)榇嬖诩夹g(shù)難題而沒有將研究重點(diǎn)放在膜蛋白上。

    現(xiàn)在，經(jīng)過傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)家的不懈努力，蛋白表達(dá)、溶解和結(jié)晶這一系列的技術(shù)瓶頸都得到了突破，并且已經(jīng)出現(xiàn)了部分成果。

2007年和2008年，學(xué)術(shù)界接連發(fā)表了好幾篇具有里程碑意義的文章，這幾篇文章都是有關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein–coupled receptor, GPCR)結(jié)晶體結(jié)構(gòu)這一傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)學(xué)難題方面的論文。

    諸如美國紐約膜蛋白結(jié)構(gòu)協(xié)會(New York Consortium on Membrane Protein Structures, NYCOMPS)和膜蛋白結(jié)構(gòu)中心(Center for Structures of Membrane Proteins, CSMP)這樣的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究組織和其他的幾家國際性研究組織正在攜手共同努力制定一個(gè)高效的、規(guī)范化的技術(shù)流程來研究膜蛋白結(jié)構(gòu)。到目前為止，已經(jīng)得到了幾個(gè)膜蛋白的結(jié)構(gòu)資料。與此同時(shí)，不需要使用蛋白結(jié)晶體來研究結(jié)構(gòu)的固態(tài)核磁共振(solid-state NMR)技術(shù)也得到了飛速發(fā)展，不過該技術(shù)在敏感度和分辨率方面還需要進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)。

    現(xiàn)在還不太可能得到一個(gè)“通用的、萬能的”技術(shù)流程來分析所有的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此還需要開發(fā)出其它一些針對不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究方法。我們相信，未來幾年會出現(xiàn)更多的研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的方法，在PDB中也會找到更多膜蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。

八 光學(xué)顯微鏡觀察較厚樣品不再是難題

    隨著對較厚樣品光學(xué)成像能力的增強(qiáng)，使用光學(xué)成像技術(shù)來觀察活體內(nèi)的生物過程正逐漸成為可能。

    生物體都是三維結(jié)構(gòu)的，即使活體狀態(tài)下的細(xì)胞也很少會像它們在培養(yǎng)皿中那樣呈現(xiàn)出單獨(dú)的單層狀態(tài)。不過，在進(jìn)行活體研究時(shí)歷來就存在技術(shù)困難，尤其是在活體成像技術(shù)方面更是沒有什么突破。

    生物組織大部分都是不透光的，而且對光的散射能力特別強(qiáng)，因此，觀察較厚組織時(shí)很難獲得質(zhì)量較好的圖像。例如，使用傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡就無法觀察厚度超過數(shù)百微米的樣品，但果蠅幼蟲(fruitfly larva)、哺乳動(dòng)物的胚胎(mammalian embryo)或者組織切片等樣品的厚度通常都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這個(gè)范圍。另一方面，研究人員也希望能獲得這些樣品的整體圖像，從而能對這些樣品的組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)情況有個(gè)整體了解，不過這些要求對于傳統(tǒng)的光學(xué)成像技術(shù)來說都難以達(dá)到。盡管現(xiàn)在有了核磁共振成像技術(shù)(magnetic resonance Imaging，MRI)，在觀察的深度方面有了一定的提高，但圖像的分辨率還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到要求。

    因此，在類似共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)這類高分辨率的成像技術(shù)和能進(jìn)行活體觀察但分辨率較低的成像技術(shù)(如MRI)之間就出現(xiàn)了一道分水嶺。不過，最近幾年間出現(xiàn)的幾種新的光學(xué)成像技術(shù)有望消除這道鴻溝。

    單層光顯微技術(shù)(light sheet microscopy)這項(xiàng)最近獲得改進(jìn)的傳統(tǒng)技術(shù)能對厚達(dá)數(shù)毫米的樣品進(jìn)行觀察，并能進(jìn)行熒光成像。該技術(shù)已經(jīng)成功用于觀察細(xì)小生物體和胚胎組織。去年，有科研工作者使用改進(jìn)的單層光顯微技術(shù)觀察斑馬魚胚胎在24小時(shí)內(nèi)的發(fā)育狀況，并獲得了數(shù)千個(gè)細(xì)胞的整體圖像。

    相比之下,諸如光學(xué)投影層析成像技術(shù)(optical projection tomography，OPT)這類層析成象技術(shù)就需要先對樣品進(jìn)行多角度觀察，然后再使用數(shù)字技術(shù)重建，才能獲得三維圖像。OPT可以對厚度達(dá)到10毫米的樣品進(jìn)行成像。去年，有人將OPT技術(shù)和體外器官培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合起來，獲得了發(fā)育中的小鼠肢芽(limb bud)組織遷移以及基因表達(dá)情況的圖像。

    雖然上述三維成像技術(shù)和其它的一些三維成像技術(shù)還沒有被大眾廣泛接受，但人們相信，隨著這些技術(shù)的不斷改進(jìn)，隨著大家對這些技術(shù)的不斷了解，它們很快就會得到廣泛應(yīng)用的。

九 試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA靶基因

    盡管現(xiàn)在人們可以越來越準(zhǔn)確地預(yù)測microRNA的沉默效果，但還是需要高通量而且準(zhǔn)確的直接驗(yàn)證技術(shù)來驗(yàn)證microRNA的沉默效果。

    microRNA這個(gè)在生物科學(xué)史上具有重要意義的小分子，在2008年又一次成為了世人矚目的焦點(diǎn)。microRNA通過與目標(biāo)mRNA的3’UTR區(qū)域結(jié)合來阻止其翻譯，具體作用機(jī)制可分為兩種：一種是降解目標(biāo)mRNA從而達(dá)到阻止其翻譯的目的，另一種則是直接抑制mRNA的翻譯過程。

    為了了解細(xì)胞中基因的真正生物學(xué)意義，研究人員往往會使用很多microRNA分子來沉默細(xì)胞中大量的mRNA表達(dá)，有時(shí)候這些被沉默基因的數(shù)目甚至比所使用的microRNA數(shù)目還要多。而現(xiàn)在使用的計(jì)算機(jī)預(yù)測靶基因技術(shù)還不夠成熟，非常容易出錯(cuò)。鑒于此，去年人們開始使用一種新型的大規(guī)模驗(yàn)證方法，即在硅片上進(jìn)行microRNA靶基因驗(yàn)證的“濕試驗(yàn)(真正的試驗(yàn)而不是用計(jì)算機(jī)模擬的“干”試驗(yàn))”。

    由于采用了這種方法，研究人員在2008年取得了一系列的成果。Nikolaus Rajewsky小組和David Bartel小組都各自獨(dú)立地將蛋白質(zhì)組學(xué)與分子生物技術(shù)結(jié)合在一起，使用定量質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測了細(xì)胞里蛋白質(zhì)組水平的蛋白表達(dá)變化情況，然后將這些蛋白表達(dá)的改變情況與特定microRNA分子的多少聯(lián)系起來進(jìn)行分析，以此來驗(yàn)證microRNA的靶基因沉默效果。因?yàn)?span lang="EN-US">microRNA作用的結(jié)果就是導(dǎo)致某些蛋白表達(dá)量的減少，因此在蛋白質(zhì)組水平上進(jìn)行定量的檢測是應(yīng)該可以檢測到這些蛋白表達(dá)量下降的。因此，使用該技術(shù)從理論上說是能夠準(zhǔn)確判斷microRNA分子是否能夠有效沉默靶基因的。

    另一種從整體水平上來檢測microRNA靶基因沉默效果的辦法就是降解組測序法(degradome sequencing)(降解組，見文后小詞典)。Pamela Green小組和Michael Axtell小組曾經(jīng)在植物研究中使用過這一種新方法。在研究microRNA靶基因沉默效果時(shí)科研人員對microRNA介導(dǎo)的mRNA降解產(chǎn)物進(jìn)行了測序，然后再使用這些被測出的序列與microRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對就能發(fā)現(xiàn)是哪些microRNA分子導(dǎo)致了這一種mRNA分子降解。這一技術(shù)在植物microRNA研究中應(yīng)用得非常成功，能非常準(zhǔn)確地預(yù)測出microRNA針對的靶基因。不過，在其它以前還未能很好進(jìn)行預(yù)測的物種中，這種方法的準(zhǔn)確率有多高還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

    與此同時(shí)，生物信息學(xué)家還在不斷豐富他們的數(shù)據(jù)庫，希望用更多的數(shù)據(jù)加以比對，從而提高計(jì)算機(jī)預(yù)測的準(zhǔn)確率。其中的一種比對方法就是mirWIP方法。該方法由Victor Ambros小組設(shè)計(jì)，他們使用的是已經(jīng)經(jīng)過免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證過的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)microRNA數(shù)據(jù)庫及其相應(yīng)靶mRNA數(shù)據(jù)庫，希望這樣能夠提高計(jì)算機(jī)預(yù)測的準(zhǔn)確率。

    上述整體水平檢測方法都極大提高了人們預(yù)測microRNA靶基因的準(zhǔn)確率，也為人們進(jìn)行下一步的試驗(yàn)驗(yàn)證工作提供了更準(zhǔn)確的候選microRNA分子，不過最終還是需要高通量的“濕試驗(yàn)”來進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。

十 光調(diào)控細(xì)胞功能——新的研究方向

    現(xiàn)在，人們不僅可以用光來觀察細(xì)胞活動(dòng)，還可以用光來控制細(xì)胞活動(dòng)，這方面的研究正在興起之中。

2005年，Georg Nagel實(shí)驗(yàn)室和Karl Deisseroth實(shí)驗(yàn)室的聯(lián)合研究證實(shí)，光激活細(xì)菌(信號轉(zhuǎn)導(dǎo))通路channelrhodopsin-2(ChR2)能活化神經(jīng)信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))。由于該過程簡單易操作，激發(fā)了神經(jīng)科學(xué)家的極大興趣。

   Negel實(shí)驗(yàn)室還展示了光活化的腺苷酸環(huán)化酶，并把這個(gè)技術(shù)延伸到新的信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))通路領(lǐng)域。

   另外一個(gè)研究小組通過在神經(jīng)元表達(dá)ChR2并且用光線照射細(xì)胞，可以隨意使神經(jīng)元去極化，并精確控制該神經(jīng)信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))基礎(chǔ)下的示蹤行為。

    2007年，該研究小組在早期研究基礎(chǔ)上做出改進(jìn)，指出一個(gè)新的光敏通道可以使細(xì)胞超級化從而抑制神經(jīng)信號。他們成功地在體內(nèi)并聯(lián)使用兩個(gè)通道去激發(fā)和抑制神經(jīng)信號(轉(zhuǎn)導(dǎo))。

    2008年，光調(diào)控細(xì)胞技術(shù)更是得到了長足的發(fā)展。我們有理由相信，在未來的幾年中，該技術(shù)一定會成為研究的熱點(diǎn)。

    現(xiàn)在，越來越多的研究人員了解到在神經(jīng)刺激過程中ChR2的作用。已有實(shí)驗(yàn)證明，在大腦切片組織中，或體內(nèi)研究中，ChR2是最適合進(jìn)行神經(jīng)通路研究的，并且現(xiàn)在人們已經(jīng)將ChR2的使用范圍擴(kuò)展到了行為學(xué)研究。

   研究人員可以通過遺傳學(xué)手段使小鼠大腦驅(qū)體感覺皮層(somatosensory cortex)細(xì)胞中表達(dá)ChR2。例如，可以用光訓(xùn)練這種小鼠，然后研究表達(dá)有ChR2的神經(jīng)元細(xì)胞對短暫的光刺激產(chǎn)生的動(dòng)作電位(action potential)有何變化?；蛘呖梢允褂冒唏R魚做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光照可以引起大腦軀體感覺神經(jīng)元(somatosensory neuron)的一次動(dòng)作電位，繼而引起魚的躲避反應(yīng)。

   盡管，如果要將ChR2應(yīng)用到臨床還需要有很長的一段路要走，但研究人員還是取得了一定的進(jìn)展。他們在大鼠脊髓損傷后，將ChR2轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞之中，然后再進(jìn)行光照刺激，結(jié)果恢復(fù)了大鼠的呼吸功能。同樣，在視網(wǎng)膜變性的動(dòng)物視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)ChR2，也能恢復(fù)其視敏感度。事實(shí)上，去年光控技術(shù)領(lǐng)域的研究不僅僅限于對ChR2的研究，其它的光相關(guān)技術(shù)也有不同程度的進(jìn)展。例如，光定位生物樣品中目標(biāo)區(qū)域的速度及靈活性方面就有了明顯的提高，因此，也就改進(jìn)了通過光照來釋放細(xì)胞中生物活性物質(zhì)的技術(shù)。此外，也出現(xiàn)了許多新的光激活物質(zhì)可供生物學(xué)家使用。這些新產(chǎn)品不僅僅包括傳統(tǒng)的小分子可被激活物質(zhì)，還包括一系列光敏感的可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行遺傳改造的產(chǎn)品。盡管光“控”細(xì)胞技術(shù)永遠(yuǎn)也不可能取代光“照”細(xì)胞技術(shù)的地位，但光“控”細(xì)胞技術(shù)一定會越來越強(qiáng)大，顯示出它自身的實(shí)力的。

         來源：丁香園http://www.biomart.cn/experiment/628/629/58166.htm

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