熒光全內(nèi)反射技術(shù)詳解

大于臨界角的光線從高密介質(zhì)向低密介質(zhì)時(shí)，在界面處并不是所有的光都被反射，而是有一部分光會(huì)穿透介質(zhì)表面，到達(dá)低密介質(zhì)內(nèi)，但這部分光的強(qiáng)度會(huì)隨著穿透深度的增加而成指數(shù)級(jí)迅速衰減，我們稱這部分光為消逝波消逝波消逝波。全內(nèi)反射熒光顯微鏡利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波場來照明樣品，從而致使在百納米級(jí)厚的光學(xué)薄層內(nèi)的熒光團(tuán)受到激發(fā)，熒光成像的信噪比大大提高。

細(xì)胞學(xué)研究中經(jīng)常使用共聚焦顯微鏡研究薄層切片，但共聚焦的激發(fā)光要穿透整個(gè)標(biāo)本，然后通過在采集端進(jìn)行遮擋的方法采集薄層圖象信息。受到光學(xué)顯微鏡衍射極限的限制，共聚焦顯微鏡的軸向分辨率約為350nm左右。共聚焦需要在熒光采集端進(jìn)行阻擋和分光等設(shè)置，往往采集熒光的光路很長采集效率很低，因而需要使用較強(qiáng)的激發(fā)光去照射標(biāo)本，標(biāo)本的殺傷和熒光的漂白都很明顯。另外共聚焦受到掃描速度和采集效率的限制往往采集圖象速度較慢，不能快速的獲得清晰的微弱熒光圖象

TIRF的特點(diǎn)就是利用薄層激發(fā)，激發(fā)光能夠照亮的范圍只有百納米級(jí)，因此更深層的熒光不會(huì)干擾我們要觀察的表面信號(hào)，而且這種薄層激發(fā)對(duì)標(biāo)本的殺傷也很小。TIRF顯微鏡采集信號(hào)時(shí)通常是直接使用離物鏡最近的側(cè)光口采集熒光，因此采集的熒光信號(hào)背景極低、熒光損失極小，也就是有很高的圖象信號(hào)噪音比（信噪比、S/N）。TIRF技術(shù)通常使用量子效率達(dá)到90％的背感光高敏感度的EM-CCD，通過高效采集和高敏感的電子放大技術(shù)可以高速的獲取極弱熒光圖象。

TIRF技術(shù)非常適合活細(xì)胞相關(guān)的膜表面成像、囊泡運(yùn)輸、胞吞胞吐作用、病毒侵染和單分子熒光成像等相關(guān)研究。

 

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