顯微鏡數(shù)字化讓病理學(xué)精確診斷

新問題層出不窮

病理學(xué)前所未有的發(fā)展也提出了許多新的問題讓我們思考。組織結(jié)構(gòu)和免疫組織化學(xué)表型相同的肺腺癌存在著不同的驅(qū)動(dòng)基因，而普通型乳腺癌則具有不同的分子變化譜，東西方肝細(xì)胞癌則具有不同的病因以及不同的分子學(xué)發(fā)病通路。非常令人迷惑的是EwSRl基因。Ewing／PNET肉瘤是EWSRl基因與近十個(gè)不同基因融合的結(jié)果，但EwsRl基因與其他基因融合則可發(fā)生多種組織形態(tài)的軟組織腫瘤；而同樣的EwSRl．ATF融合則可出現(xiàn)在血管瘤樣纖維組織細(xì)胞瘤和部分透明細(xì)胞肉瘤。即同一腫瘤可能由不同分子介導(dǎo)，而不同腫瘤可能有同一分子改變。這些事實(shí)提示腫瘤細(xì)胞分化方向與途徑(即組織發(fā)生學(xué)或表型特征)可能與腫瘤驅(qū)動(dòng)基因介導(dǎo)的過程是相互相對(duì)獨(dú)立的事件。同時(shí)，腫瘤靶向治療的實(shí)踐表明，我們更應(yīng)該注意那些同類腫瘤中僅在部分腫瘤表達(dá)和突變的分子，在傳統(tǒng)的分析中由于統(tǒng)計(jì)學(xué)處理這類分子改變難以達(dá)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而通常被忽視。過去我們一般注意分子改變的普遍性，例如，在結(jié)腸癌或肺癌中只注意那些普遍存在的過表達(dá)的基因，現(xiàn)在看來(lái)今后的研究應(yīng)當(dāng)更加注意對(duì)觀測(cè)指標(biāo)分析的標(biāo)準(zhǔn)即閾值、終點(diǎn)的設(shè)置。這些問題也同樣存在于現(xiàn)在對(duì)腫瘤預(yù)后因子的研究中，目前多數(shù)研究仍集中于確定具有普遍意義的預(yù)后預(yù)測(cè)因子，如果考慮到表型與分子事件之間的相對(duì)獨(dú)立性，確定具有普遍意義的預(yù)后預(yù)測(cè)因子不一定具有可行性。事實(shí)上，目前發(fā)現(xiàn)的預(yù)后因子多數(shù)僅反應(yīng)某些類型的預(yù)后意義就不難理解：如N-myc擴(kuò)增僅僅反映部分神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后。所以，預(yù)后因子可能與驅(qū)動(dòng)基因有關(guān)，也具有類型的特異性。

對(duì)腫瘤的異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)需要不斷深化。過去病理學(xué)界對(duì)腫瘤異質(zhì)性的關(guān)注只是著重于表型的異質(zhì)性(分化與結(jié)構(gòu)，或生物學(xué)行為)，而腫瘤靶向治療實(shí)踐顯示這種表型的異質(zhì)性似乎并不十分重要，而分子層面的異質(zhì)性可能更值得探討。那么分子的異質(zhì)性性又應(yīng)該從哪些方面考察呢？可能應(yīng)考慮：(1)驅(qū)動(dòng)基因突變方式：不同的突變方式與下游的活化狀態(tài)，以及藥物敏感性的差異；(2)驅(qū)動(dòng)基因介導(dǎo)的信號(hào)通路基因改變；(3)p53、RB、PTEN、BRCAl、錯(cuò)配修復(fù)(MMR)等腫瘤抑制基因的狀態(tài)；(4)腫瘤細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定性：如基因組隨機(jī)性改變，尤其是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的染色體碎裂(chromothripsis)所引起的基因組異常；(5)與腫瘤微環(huán)境、代謝相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制；(6)在靶向治療過程中檢測(cè)到的“新發(fā)”突變，究竟確為新發(fā)，還是腫瘤異質(zhì)性的結(jié)果(原先主宰腫瘤的優(yōu)勢(shì)克隆被抑制后，耐藥克隆轉(zhuǎn)變成主宰克隆)，還有我們尚未發(fā)現(xiàn)的因素。另外，常見的p53、RB、PrEN等腫瘤抑制基因以及RAS、myc癌基因涉及眾多腫瘤，具有普遍性，且相關(guān)作用途徑已經(jīng)大致清晰，但目前仍缺乏作為靶點(diǎn)的有效干預(yù)手段。腫瘤增殖特性評(píng)估尚缺乏更好的指標(biāo)，尤其是部分高度惡性腫瘤其Ki-67陽(yáng)性指數(shù)不高，許多上皮性癌Ki-67的參考意義不大，表明對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)仍然十分局限。此外，腫瘤靶向治療的實(shí)踐也挑戰(zhàn)我們的許多傳統(tǒng)觀念。其中，值得注意的是有關(guān)腫瘤惡性度的問題。這些年因?yàn)榕R床對(duì)部分腫瘤有了有效的治療方法，尤其是乳腺癌、肺腺癌、黑色素瘤等惡性度較高的腫瘤，表明腫瘤的惡性度也具有相對(duì)性，是否具有有效的治療手段，較單純的惡性度判斷更為重要。

原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移瘤的平行發(fā)生理論值得關(guān)注。腫瘤靶向治療顯示針對(duì)原發(fā)癌的有效藥物對(duì)轉(zhuǎn)移癌也同樣有效，表明至少部分轉(zhuǎn)移癌的分子特性依然保持著原發(fā)癌的特征。似乎轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療并非像過去認(rèn)為的那樣困難。同時(shí)值得關(guān)注的是近年來(lái)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展，如腫瘤干細(xì)胞理論，轉(zhuǎn)移與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，即腫瘤轉(zhuǎn)移可能伴隨著其形成的全過程，這些對(duì)腫瘤病理檢查、轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)度、治療效果判斷、標(biāo)志物的篩選均可能帶來(lái)影響。對(duì)于這些問題我們目前尚無(wú)確切的答案，但發(fā)現(xiàn)這些問題則是解決的開端。

 

 

從圖像分析軟件到安裝在手機(jī)上的無(wú)透鏡顯微鏡，計(jì)算創(chuàng)新及其新的工具正在給病理學(xué)家們提供更清晰、更富含信息的圖像。

 

然而，病理學(xué)依然是一門頑固的模擬的和定性的科學(xué)。經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家的主要工具是載玻片——200多年幾乎沒有改變的復(fù)式顯微鏡外加一雙眼睛。耶魯醫(yī)學(xué)院病理學(xué)家戴維·里姆（David Rimm）說(shuō)：“病理學(xué)家的大多數(shù)醫(yī)療決策是根據(jù)形態(tài)學(xué)定義的。”也就是顯微鏡下細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。

當(dāng)然，方法的陳舊決不是放棄它的原因。但是，數(shù)字式病理學(xué)倡導(dǎo)者們擔(dān)憂的是（決策）不一致會(huì)帶來(lái)假陰性或誤診。比如，在鑒定罕見腫瘤時(shí)，有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家往往比年輕人做得好，但是，彼此經(jīng)常出現(xiàn)判斷不一致，尤其是對(duì)同一個(gè)樣品的不同評(píng)估，這是矛盾的。

數(shù)字式病理學(xué)早期提倡者、俄亥俄州立大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)家梅廷·居爾坎（Metin Gurcan）認(rèn)為，臨床數(shù)字化的障礙在于圖像的大小和其處理過程復(fù)雜性。首先，要將活檢組織切成多個(gè)部分并放在多個(gè)載玻片上，一個(gè)載玻片在顯微鏡下放大得到的數(shù)字式圖像大約有100億個(gè)像素，需要30千兆字節(jié)的內(nèi)存。例如，典型的前列腺穿刺活檢使用20多張載玻片，需要大約600千兆字節(jié)。

接著，便是大量的數(shù)據(jù)等待著病理學(xué)家的掃描或軟件的篩選。居爾坎說(shuō)：“在這些圖像中解讀細(xì)胞數(shù)目和類型是令人難以置信的。”然而，一種與這種復(fù)雜性打交道的方法就是通過軟件來(lái)識(shí)別和解讀，就像人所做的那樣，而且更快速、一致。

正如人們通過學(xué)習(xí)來(lái)掌握知識(shí)那樣，軟件也可以。2011年，哈佛醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)家安德魯·貝克（Andrew Beck）建立了一種稱為C-Path的學(xué)習(xí)軟件，結(jié)合248名患者的乳腺癌活檢圖像和生存資料，該軟件學(xué)習(xí)后可以給乳腺癌患者進(jìn)行評(píng)分和預(yù)測(cè)其存活率。

在顯微鏡下觀察活檢組織，病理學(xué)家主要憑借癌細(xì)胞三個(gè)特有的特征來(lái)甄別腫瘤的攻擊性：細(xì)胞核形狀是否異常？細(xì)胞是否正在分裂？細(xì)胞彼此是否正常連接或分離？病理學(xué)家們將這些特征逐項(xiàng)量化后以此確定腫瘤級(jí)別及描述其攻擊性如何。

而C-Path系統(tǒng)的工作原理是，將圖像分割成“超像素”小區(qū)域，在每個(gè)超像素內(nèi)鑒別細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并與鄰近的超像素比對(duì)――顏色、紋理、大小和外形。對(duì)于乳腺癌，這種比對(duì)分析產(chǎn)生的特征與兩種事物相關(guān)：樣品的全結(jié)構(gòu)和其精細(xì)比例細(xì)節(jié)，例如，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞核之間的平均距離。

最后，C-Path得到的6 642個(gè)特征結(jié)構(gòu)，在描述癌細(xì)胞自身的同時(shí)，還包括周圍基質(zhì)的連接組織。事實(shí)上，基質(zhì)形態(tài)學(xué)比單獨(dú)的癌癥形態(tài)學(xué)具有更好的存活預(yù)測(cè)因子：基質(zhì)區(qū)域形態(tài)一致與良好的預(yù)后有聯(lián)系，而被上皮細(xì)胞浸潤(rùn)的基質(zhì)，則指示程度較高的進(jìn)展性癌癥?；趯?duì)數(shù)千個(gè)特征結(jié)構(gòu)的分析，C-Path做出了比標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)分析更準(zhǔn)確的患者存活率分析。貝克現(xiàn)在在更廣范圍樣品中訓(xùn)練他的軟件，包括全玻片圖像和正常乳腺組織樣品。

 

有可能的是，病理學(xué)家也會(huì)尋找到由C-Path計(jì)算出的數(shù)千特征結(jié)構(gòu)中的一些特征，但卻難以用詞語(yǔ)來(lái)表述它們。比如，將一例確診的腫瘤和在一幅照片中識(shí)別出你叔叔的經(jīng)歷進(jìn)行比對(duì)。你不能確切地說(shuō)清楚他是你叔叔――是他的鼻子、眼睛還是衣服？只知道這就是他。但是，計(jì)算機(jī)卻可以量化分析一幅圖像的特征，并且可以重復(fù)。

也有人認(rèn)為，作為第二雙犀利的眼睛，軟件的正確用途應(yīng)該是幫助醫(yī)生從海量數(shù)據(jù)中尋找或?qū)δ繕?biāo)物進(jìn)行分類，以此減輕他們的工作量。安阿伯市密歇根大學(xué)的病理信息學(xué)專家尤里西斯·巴利斯（Ulysses Balis）正在開發(fā)一種稱為SVIQ的通用視覺搜索程序。

為了對(duì)SVIQ進(jìn)行實(shí)證，巴利斯通過不同角度對(duì)大腸腺癌切片的數(shù)字式圖像進(jìn)行放大和縮小，如果他發(fā)現(xiàn)有趣的東西――比如一個(gè)看似正在分裂的細(xì)胞――并想在圖像中搜索其他有相似特征的結(jié)構(gòu)，就點(diǎn)擊“掃描”按鈕，軟件隨即將圖像中相似的部分亮化，前后花費(fèi)大約10秒時(shí)間。他說(shuō)：“這可能是最簡(jiǎn)單的二維圖像搜索結(jié)構(gòu)，是一個(gè)良好的應(yīng)急工具。”

與C-Path主要做診斷決策不同，SVIQ軟件可以幫助病理學(xué)家在數(shù)字式病理學(xué)圖像中發(fā)現(xiàn)興趣位點(diǎn)。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）從事病理信息學(xué)研究的賈森·希普（Jason Hipp）認(rèn)為，病理學(xué)家們所能做的是逐個(gè)對(duì)視野中一些正在分裂的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同的是，SVIQ可以對(duì)整個(gè)組織切片內(nèi)每個(gè)分裂細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，SVIQ在提高病理學(xué)家工作效率的同時(shí)，并提供更多的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。

希普的目標(biāo)之一是將SVIQ整合進(jìn)癌癥患者的篩選過程中。通常這要從發(fā)現(xiàn)癌癥患者的遺傳學(xué)試驗(yàn)開始，對(duì)于那些分散在人體內(nèi)的腫瘤，包括活檢組織在內(nèi)，一時(shí)很難發(fā)現(xiàn)足夠的癌組織進(jìn)行遺傳學(xué)篩選。一般情況下，從取出活檢組織到對(duì)其癌樣部分鑒定和染色，過程大約為25分鐘時(shí)間。通過SVIQ軟件，病理學(xué)家從發(fā)現(xiàn)圖像中某個(gè)區(qū)域的癌細(xì)胞，到亮化與其特征相似的其他結(jié)構(gòu)部分，過程大約為5分鐘。

在倫敦癌癥研究所，生物信息學(xué)研究人員袁茵茵（Yinyin Yuan，音譯）正在將腫瘤中所有細(xì)胞類型進(jìn)行作圖，旨在獲得它們的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。她說(shuō)：“腫瘤內(nèi)不同細(xì)胞群體產(chǎn)生的復(fù)雜景觀，成為了精確診斷的障礙。”由于對(duì)腫瘤部分取樣進(jìn)行的測(cè)序不能捕獲其全部圖像，進(jìn)而丟失了癌癥－細(xì)胞群體的異質(zhì)性，進(jìn)一步影響到患者的預(yù)后和他們對(duì)不同治療方案的應(yīng)答。

2012年袁開發(fā)了一款軟件，對(duì)取自300個(gè)乳腺癌組織活檢全腫瘤載玻片的大約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞逐一進(jìn)行分類，然后與其他“組學(xué)”數(shù)據(jù)進(jìn)行集成（由100個(gè)計(jì)算芯片組成的計(jì)算機(jī)簇完成這項(xiàng)工作）。通過與其他腫瘤數(shù)據(jù)比對(duì)（該軟件輸出的是數(shù)據(jù)，不是圖像），袁發(fā)現(xiàn)，那些免疫細(xì)胞滲入腫瘤的患者有更好的預(yù)后。當(dāng)圖像數(shù)據(jù)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)連接時(shí)，這種預(yù)測(cè)得到了增強(qiáng)。當(dāng)病理學(xué)家凝視基因表達(dá)數(shù)據(jù)清單時(shí)，這種結(jié)果并不明顯，但當(dāng)該軟件分析圖像時(shí)，就變得清晰了。目前，袁計(jì)劃著將她的這項(xiàng)研究擴(kuò)展到卵巢癌和肺癌中。

 

 數(shù)字式圖像分析使病理學(xué)家工作變得輕松的同時(shí)，也催生新的硬件類型的產(chǎn)生，而制作數(shù)字式顯微鏡圖像，則意味著需要較為昂貴的掃描顯微鏡鏡片。目前，研究人員正在開發(fā)既掃描迅速又相對(duì)便宜的顯微鏡，旨在更多地提升軟件功能、較少依靠透鏡或其他硬件。

在傳統(tǒng)顯微鏡中，低倍透鏡是犧牲分辨率得到寬視野，而高分辨率則只能看到小的視野。在帕薩迪納加州理工學(xué)院從事顯微鏡技術(shù)研發(fā)的楊長(zhǎng)輝（Changhuei Yang，音譯）說(shuō)：“機(jī)械掃描相對(duì)緩慢。”他的解決方案是增加傳統(tǒng)顯微鏡的視野和分辨率。2013年7月，楊長(zhǎng)輝將一架低分辨率光學(xué)顯微鏡改裝成一架高分辨率顯微鏡，進(jìn)而可以用便宜的硬件制作全玻片圖像——在0.8毫米的分辨率下觀察到120平方毫米的面積。而標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡在這個(gè)分辨率下只能提供1.1平方毫米的視野。  

更進(jìn)一步的是，加州大學(xué)洛杉磯分校的電子工程師埃道甘·奧茲坎（Aydogan Ozcan）正在研發(fā)一款無(wú)透鏡的顯微鏡，擅長(zhǎng)處理生物學(xué)“濕件”樣品，能夠完成物理透鏡所做的同樣事情：將模糊的干涉模式轉(zhuǎn)換成細(xì)胞的聚焦圖像。在細(xì)節(jié)上，其致密顯微鏡與透鏡顯微鏡完全一樣，擁有數(shù)百納米分辨率，可以清晰地顯示細(xì)胞核。

與此同時(shí)，奧茲坎還在嘗試眾包他的診斷學(xué)儀器——將顯微鏡制作的血液細(xì)胞圖像上傳到一個(gè)連線游戲上（一個(gè)非專業(yè)人士認(rèn)識(shí)感染瘧疾的細(xì)胞的教學(xué)游戲），供眾多游戲迷游戲，然后對(duì)答案做統(tǒng)計(jì)學(xué)綜合。結(jié)果，這款游戲產(chǎn)生與病理學(xué)家相同診斷的次數(shù)比例達(dá)99%。奧茲坎認(rèn)為，這款智能軟件最終能從病理學(xué)家那里接管部分事務(wù)。

亞里桑那州鳳凰城視覺門公司首席執(zhí)行官艾倫·納爾遜（Alan Nelson）認(rèn)為，計(jì)算創(chuàng)新將會(huì)給病理學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)改變。目前，他正在研發(fā)針對(duì)血液中癌細(xì)胞三維成像的自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)。他說(shuō)：“機(jī)器不會(huì)給出意見，它能產(chǎn)生的是數(shù)據(jù)和基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的診斷。”該系統(tǒng)有望增加篩查速率，幫助病人更快地得到治療。

納爾遜曾是目前市場(chǎng)上唯一的自動(dòng)化癌癥篩查儀的首席發(fā)明人，其NeoPath公司研發(fā)的宮頸癌檢測(cè)儀，在1996年獲得美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）的批準(zhǔn)——這款檢測(cè)儀是專門為測(cè)定宮頸帕氏涂片內(nèi)癌細(xì)胞而定制，載有數(shù)百片載玻片，可以終日進(jìn)行自動(dòng)化掃描。

當(dāng)今的計(jì)算機(jī)已今非昔比。納爾遜稱，在軟件的輔助下，顯微鏡可以向生物學(xué)家和醫(yī)生展示以前他們從沒看到的事物：奧茲坎的無(wú)透鏡顯微鏡已經(jīng)向人們展示了精子螺旋運(yùn)動(dòng)的新模式，視覺門公司的三維圖像可以向病理學(xué)家展示數(shù)百種以前無(wú)法看到的特征結(jié)構(gòu)。“我們可以清晰地看到肺癌細(xì)胞核內(nèi)的表面紋理，或測(cè)量出六號(hào)染色體短臂的長(zhǎng)度，我的上帝呀，真是太美了！”