如何構(gòu)建和提升顯微鏡

許多生物科學(xué)家都將他們的顯微鏡與照相機(jī)相連以進(jìn)行記錄并分析圖像。如今的顯微照相機(jī)，已經(jīng)由電傳感器取代了膠片。其中最早的一種傳感器是電荷耦合元件，它利用像素矩陣捕獲光線并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。許多制造商仍在使用這種類型的傳感器，它們是極其可靠的。

成本較低的互補(bǔ)金屬氧化半導(dǎo)體則來源于集成電路產(chǎn)業(yè)。這種傳感器也將光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，但它需要在傳感器上有更多的電路，這樣就占用了感應(yīng)的空間，因此這項(xiàng)技術(shù)通常比不上CCD的光線敏感度。然而，由于像素是集中檢測(cè)而非單個(gè)檢測(cè)，CMOS傳感器可以得到比CCD傳感器更快的幀率。CMOS的新版本——科學(xué)CMOS，通過在維持速度的情況下提供更強(qiáng)的敏感性，解決了該技術(shù)的缺陷。

然而，不同的應(yīng)用常常決定了照相機(jī)哪一種獨(dú)特的性能是必要的。“如果你在構(gòu)建一種簡(jiǎn)單的顯微鏡，只為拍攝一個(gè)被H&E染色的樣品照片，你不需要過分奢侈的照相機(jī)。”如果你需要更高的成像速率或者檢測(cè)弱熒光信號(hào)的能力，Richardson說，“你可能會(huì)從一臺(tái)價(jià)值2000美元的照相機(jī)升級(jí)到一臺(tái)價(jià)值20000或30000美元的照相機(jī)。”前者可能是一個(gè)高端消費(fèi)型CCD照相機(jī)，而后者則可能是個(gè)sCMOS照相機(jī)。

制造商也在繼續(xù)通過各種感應(yīng)器在顯微照相機(jī)中謀求新的發(fā)展。

科學(xué)家在為顯微鏡配備相機(jī)時(shí)，可以從其他裝載了16毫米對(duì)角線CCD的選擇中做決定，例如由加拿大不列顛哥倫比亞省薩里市QImaging公司制造的Retiga 6000。QImaging的產(chǎn)品經(jīng)理Chris Ryan介紹，這一照相機(jī)“的服務(wù)對(duì)象是那些想要掃描整張載玻片或同時(shí)監(jiān)測(cè)大群細(xì)胞（如高容量篩選）的客戶。”

例如，在熒光成像中，科學(xué)家考慮的是敏感性和分辨性，Ryan說。敏感性決定著可以檢測(cè)出的最弱的熒光信號(hào)，而分辨性則顯示了圖像可以識(shí)別的最細(xì)微的特征。“那些特征是照相機(jī)與物鏡的組合。”Ryan說。

在某些情況下，生物科學(xué)家可能傾向于具有一系列特征的照相機(jī)。若是如此，他們可能會(huì)選擇sCMOS的照相機(jī)。例如，愛爾蘭貝爾法斯特Andor技術(shù)公司的生命科學(xué)應(yīng)用專家Orla Hanrahan提到了Andor的Zyla 4.2系統(tǒng)。“這臺(tái)儀器可以提供敏感性、速度和廣闊的視野，就像一臺(tái)全能的照相機(jī)。”Hanrahan說。

然而，在低光成像中，研究者可能更傾向于電子倍增電荷偶聯(lián)的照相機(jī)。EMCCD包括了能將常規(guī)CCD的輸出結(jié)果倍增的電荷設(shè)備。因此，EMCCD可以檢測(cè)微弱的信號(hào)。例如，美國亞利桑那州圖森Photometrics公司的Evolve 512 Delta系統(tǒng)使用的就是EMCCD傳感器。然而，Photometrics的產(chǎn)品經(jīng)理Rachit Mohindra卻指出了其中的缺點(diǎn)：“在如此低光水平下工作，EMCCD照相機(jī)使用的傳感器像素更大，會(huì)在給定的范圍內(nèi)收集更多的光，因此你看不到更精準(zhǔn)的細(xì)節(jié)。”

 

如今的生物科學(xué)家經(jīng)常對(duì)活體細(xì)胞進(jìn)行成像。傳統(tǒng)上，科學(xué)家大多在觀測(cè)死的細(xì)胞，這些細(xì)胞的制作過程會(huì)使樣品非常健壯，能夠在不受特殊關(guān)照的情況下保存若干年。與之相比，活細(xì)胞必須得到精心培養(yǎng)以使它們保持活性。美國加州卡爾斯巴德的生命科技公司高級(jí)研發(fā)經(jīng)理Michael O'Grady說：“為了得到清晰的圖像，你需要保持細(xì)胞的健康。”

為此，科學(xué)家必須在觀測(cè)活細(xì)胞時(shí)維持特殊的環(huán)境條件。為了決定哪個(gè)設(shè)備為特殊的應(yīng)用提供最優(yōu)的條件，科學(xué)家可以咨詢專家，例如美國伊利諾伊州維斯塔蒙特市McCrone顯微鏡及配件公司的儀器銷售部總裁與主任Jeffrey D. McGinn。他說：“當(dāng)有人聯(lián)系到我們，我們會(huì)進(jìn)行一些需求評(píng)估的問卷，例如咨詢客戶想要觀測(cè)的樣品類型，以及樣品是否需要置于某種特定環(huán)境中。”因此，他可能建議配置一個(gè)溫度控制的平臺(tái)系統(tǒng)，如英國薩里市Linkam科學(xué)儀器公司所提供的平臺(tái)。這些平臺(tái)能夠保持樣品在-196℃~1，500℃的溫度范圍。其中一個(gè)應(yīng)用就需要加熱，McGinn指向制藥業(yè)。他說：“當(dāng)你加熱藥物產(chǎn)品時(shí)，可能會(huì)經(jīng)過多態(tài)的轉(zhuǎn)變。其中一些會(huì)有不同的反應(yīng)。”所以藥學(xué)科學(xué)家可能要將樣品暴露在一系列的溫度范圍中，以尋找轉(zhuǎn)變點(diǎn)。在另一個(gè)例子中，研究者可能僅需要在成像實(shí)驗(yàn)中讓細(xì)胞樣品維持在體溫環(huán)境中。

一些應(yīng)用甚至需要更高水平的環(huán)境控制，科學(xué)家可以利用由先進(jìn)顯微鏡公司提供的平臺(tái)式孵育器獲得，其中包括一個(gè)可控環(huán)境的培養(yǎng)室。“這一設(shè)備本質(zhì)上是EVOS熒光顯微鏡的插件。”生命科技公司產(chǎn)品經(jīng)理Hans Beernink說，“它被整合到顯微鏡中，由軟件所控制。”它可以控制其溫度、濕度、甚至是氣體，如氧氣。

 

除了要保持細(xì)胞的健康狀態(tài)，活細(xì)胞成像也帶來了其他獨(dú)特的挑戰(zhàn)。一些科學(xué)家必須克服光學(xué)上的障礙，另一些則偏向于機(jī)械問題。

獨(dú)特的光學(xué)因子開始在活細(xì)胞成像中起作用。由于物鏡最初是為固定樣品所設(shè)計(jì)的，與活細(xì)胞相比具有不同的光學(xué)特性，這就造成了對(duì)于新的顯微鏡解決方法的需求。加拿大安大略省列治文山的奧林巴斯加拿大公司科學(xué)儀器部市場(chǎng)經(jīng)理Andrew Millar說：“我們有機(jī)硅浸漬的物鏡就是為成像活細(xì)胞所設(shè)計(jì)的。”他接著說，“當(dāng)使用有機(jī)硅浸沒光學(xué)后，從活細(xì)胞收集的成像更加明亮，分辨率更高。”這些物鏡可以達(dá)到30倍、40倍和60倍，可以配在任何奧林巴斯的顯微鏡上。因?yàn)橛袡C(jī)硅浸漬介質(zhì)的折射參數(shù)非常類似于活細(xì)胞的折射參數(shù)，它們提高了成像的質(zhì)量。

活細(xì)胞成像技術(shù)包含了廣泛的應(yīng)用，其中有些卻十分特殊。例如，在電生理學(xué)領(lǐng)域，一旦你將玻璃電極插入所需的神經(jīng)元中，你不希望任何東西碰到它，擔(dān)心會(huì)突然地終止你的記錄。但是如果你想要看一下旁邊的物體，甚至是放入第二個(gè)電極？你不能夠移動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)，但是有些技術(shù)卻可以讓你將物鏡重新定位，如佛蒙特州威利斯頓市MBF生物科技公司的徑向移動(dòng)物鏡。“它能夠使物鏡在x和y方向上移動(dòng)。”該公司總裁 Jack Glaser介紹，“樣品固定不動(dòng)，通過物鏡移動(dòng)來掃描不同的點(diǎn)。”Glaser接著說，RMO能夠配合大部分的顯微鏡和物鏡。“你只需要轉(zhuǎn)動(dòng)鏡頭轉(zhuǎn)輪，換成RMO，旋緊旋鈕，就能夠使用了。”Glaser解釋道。RMO配備的控制盒能夠讓計(jì)算機(jī)移動(dòng)物鏡。

 

無論科學(xué)家是在觀測(cè)活細(xì)胞或固定樣品，控制照明對(duì)于顯微實(shí)驗(yàn)來說都是一個(gè)重要的方面，特別是對(duì)于如今需要多重激光來點(diǎn)亮樣品中不同熒光標(biāo)記的成像技術(shù)。“人們對(duì)他們的實(shí)驗(yàn)有自身的偏好和需求。”總部設(shè)在紐約州梅爾維爾的尼康儀器公司美洲市場(chǎng)和產(chǎn)品部總經(jīng)理Stephen T. Ross說。

為了幫助他們實(shí)現(xiàn)這些需求，尼康為自己的Ti倒置顯微鏡研發(fā)了新的組件。例如，尼康的LU-N激光單元能夠裝載多達(dá)8種激光，范圍是356~756納米。“這些激光單元也能夠提供多達(dá)7種不同的輸出，能夠與多種儀器相連，如熒光成像的光激活系統(tǒng)。”Ross說，“此外，這是個(gè)固態(tài)的激光系統(tǒng)，當(dāng)它從盒子中取出時(shí)，不需要反射鏡或者調(diào)解裝置。”

尼康研發(fā)的L-Apps系統(tǒng)組件與LU-N系統(tǒng)一并推出。“這些應(yīng)用組件能夠通過我們的軟件與LU-N進(jìn)行協(xié)同工作。” Ross說，“這就可以接受復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，使得它們能夠?yàn)椴煌瑢I(yè)水平的人們所使用。”當(dāng)照亮活細(xì)胞時(shí)，激光會(huì)損傷樣品。因此對(duì)于照明的控制就派上了用場(chǎng)。

為了真正減輕熒光成像中激光照明的潛在損傷，科學(xué)家可以使用雙光子顯微鏡。它通過一次性利用兩個(gè)光子激活熒光分子，來降低光對(duì)于樣品的影響，每個(gè)只攜帶一個(gè)光子能量需求的約一半。為了進(jìn)一步減少組織損傷，科學(xué)家可以使用能夠造成脈沖非常短的激光，這也能夠減少樣品應(yīng)用的能量。如今這種成像最快的激光能夠在飛秒的范圍中產(chǎn)生脈沖。

當(dāng)問及制造大多數(shù)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以使用的飛秒激光時(shí)，奧地利維也納Femtolasers Produktions公司的總裁Andreas Stingl提到了三件事：易于使用、一萬小時(shí)的生命周期和強(qiáng)大的構(gòu)造。他說：“目前，能夠在80兆赫的重復(fù)率下操作、并能在100飛秒的范圍內(nèi)傳送脈沖的可調(diào)節(jié)鈦藍(lán)寶石振蕩器，是雙光子顯微鏡使用的標(biāo)準(zhǔn)資源。”除了造成傷害較少之外，飛秒脈沖能夠比長(zhǎng)脈沖穿透更深的組織。Stingl舉例表示，“在相同的平均功率下，Sub-20飛秒脈沖比120飛秒脈沖多出160%的穿透深度。”

這種“分鐘—飛秒”的轉(zhuǎn)變對(duì)于成像的影響，揭示了當(dāng)今顯微鏡技術(shù)的精確性。但是也不應(yīng)過度關(guān)注如此微小的參數(shù)，以至于忽略了將所有正確的顯微鏡組件搭配在一起的整體需求。每一部分都很重要，它們之間的相互作用也是如此。這些都必須整合進(jìn)一個(gè)系統(tǒng)，以滿足每個(gè)科學(xué)家的需求。